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我国氨基酸研究与生产取得重大突破
发布者: 发布时间:2014-5-20 阅读:1549

    在我国生物发酵产业中,氨基酸生产占重要地位,除L-谷氨酸、L-赖氨酸及L-精氨酸等大宗氨基酸产品其生产规模及生产水平均已达到世界先进水平外,小品种氨基酸如L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸及L-缬氨酸等无论在生产规模还是在生产水平上均与国外有较大的差距。近年来,在以工业微生物发酵技术国家工程研究中心首席科学家吴松刚教授等为首的技术团队攻坚下,实现了以构建高产酸小品种氨基酸工程菌、工业微生物育种新技术及其发酵过程优化控制为主要技术路线,开展L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸及L-缬氨酸等产酸率新菌种选育和新工艺创新的研究与开发,使其产酸水平大幅提高,取得了突破性进展,达到了世界先进水平。目前,该项技术已在福建省麦丹生物集团公司投入产业化生产,该公司已分别投入300m3发酵罐和60m3发酵罐生产,为提升我国氨基酸生产作出了出色的贡献,进一步提高了在国际市场中的竞争力,突显企业作为技术创新主体地位的重要性和现实性。

  L-苯丙氨酸

  在阐明L-苯丙氨酸的代谢途径及其调控机理的前提下,首先选育酪氨酸缺陷型菌株,然后对代谢途径关键酶aroG及pheA基因进行串联表达,构建产L-苯丙氨酸工程菌株,该工程菌种在300m3发酵罐上产酸45.1g/L。在此基础上,利用基因重组技术、酶分子定向进化技术对L-苯丙氨酸关键酶基因进行改造,选育出高产工程菌株ES-4573-2,该工程菌株在300m3发酵罐上产酸65.2g/L。

  在获得ES-4573-2工程菌株的基础上,从芳香族氨基酸生物合成的共同途径,分支途径代谢调控网络着手,采用工程菌基因组敲除及工程菌质粒改造的技术路线,在基因组方面敲除了TrpE、pykA/F、CsrA基因,在质粒改造方面添加talA及Vhb基因,筛选获得新型菌株MF-0018,在300m3发酵罐上通过间歇式补料及发酵工艺优化控制,生产周期48h,产酸达82.2g/L。上述技术成果已取得福建省发改委和中国生物化学与分子生物学学会工业生物化学与分子生物学分会专家一致认可,并给予较高评价。

  L-异亮氨酸

  采用工业微生物育种新技术对一株产L-异亮氨酸黄色短杆菌BF-420进行定向培育,以望获得L-异亮氨酸高产菌株。

  以黄色短杆菌BF-420为出发菌株,通过紫外线和亚硝酸胍(NTG)复合诱变处理,筛选出一株蛋氨酸(Met-)缺陷型菌株,在此基础上,进行一步筛选出α-氨基丁酸抗性突变株,最终得到一株带有目的遗传标记的L-异亮氨酸高产突变菌株BM-2610(Met-+α-ABr),该菌株在未优化的摇瓶的条件下,可积累L-异亮氨酸7.12g/L,比出发菌株提高了122.5%。经验证BM-2610的遗传性能稳定。

  对突变菌株BM-2610的发酵条件进行了优化。考察了5种不同组分组成的种子培养基,确定较优的种子培养基;进行了发酵培养基单因素与发酵条件的试验,通过响应面分析方法优化了发酵培养基的组成配比,在优化条件下,变株BM-2610摇瓶发酵平均可积累L-异亮氨酸16.11g/L,比未优化前提高了126.3%,在此基础上,经30L发酵罐优化控制放大验证:L-异亮氨酸产酸率达55.2g/L,达到国内领先水平。

  L-色氨酸

  在获得L-色氨酸产生菌酪氨酸营养缺陷型菌株基础上,对L-色氨酸产生菌代谢途径关键酶进行分析,并将关键酶进行克隆及串联高效表达,构建高效表达的基因工程质粒,结合基因重组技术及酶分子体外定向进化技术,对L-色氨酸合成相关的关键酶基因以及工程宿主菌进行修饰和改造,提高关键酶的抗反馈抑制能力及细胞积累L-色氨酸的能力,最后利用高通量的筛选手段,选育出遗传性能稳定、具有工业生产价值的高产L-色氨酸工程菌。

  在构建L-色氨酸基因工程菌过程中,经300m3发酵罐验证试验:产L-色氨酸水平由T-103的25.3g/L,经T-503的40.6g/L到T-608的52.6g/L,最终获得高产酸工程菌TK-108,产酸高达65.8g/L,而发酵周期仅46h,达到国际领先水平。

  L-缬氨酸

  根据L-缬氨酸的生物合成途径,以工业微生物代谢育种手段,选育以提高L-缬氨酸产量为目的,能解除产生菌正常代谢机制的突变株,其主要技术路线为:以L-缬氨酸产酸菌黄色短杆菌F-208为出发菌株,制备原生质体后,经多重物理化学诱变处理,在含α-氨基丁酸(α-AB)、γ氨基丁酸(γ-AB)结构类似物的变株F-336,在30L发酵罐其发酵产酸较出发菌株提高近4倍,达70.2 g/L且产酸稳定,处于国际先进水平。

 
 

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